【导读】近期，Engineering in Life Sciences以特刊的形式刊发了苏志国教授的同事、朋友和学生在生物分离领域的一些合作历程回顾以及最新的一些分离技术进展，以此致敬苏老师在分离纯化领域的非凡贡献。https://onlinelibrary.wiley.com/toc/16182863/2021/21/6。

本文是瑞典乌普萨拉大学的Jan-Christer Janson教授撰写的论文，简要回顾了他与苏志国教授在生物分离领域的合作与创新之路。

【作者简介】Jan-Christer Janson教授任职于瑞典乌普萨拉大学，是国际著名生物分离科学家、瑞典乌普萨拉皇家科学院院士，2014年中国科学院国际科技合作奖获得者，2016年中国国际科学技术合作奖获得者。Janson教授自1980年起开始与中国同行合作提升蛋白质分离纯化的理论和技术水平，突破生物技术药物产业化的瓶颈，设计完成了一系列重组蛋白质药物的分离纯化过程并成功在中国实现产业化，其中包括乙肝疫苗、干扰素等。

【原文译本】
      1994年在新加坡参加亚太生化工程会议(APBioChEC)时，我有幸参加了中国大连理工大学苏志国教授的研讨会。研讨会的题目是《中国的生物分离》，他展示了对中国生物技术现状的深刻了解。研讨会结束后，我向苏教授介绍了自己。我们立刻意识到我们都对蛋白质纯化有浓厚的兴趣，同年他邀请我给他的学生和他部门的员工做讲座。

不久，苏教授于1997年被任命为中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室副主任，并于2001年晋升为主任。2013年至今，苏教授一直担任国家生化工程技术研究中心(北京)的首席科学家。这些年来，我们一直保持着密切的联系，共同研究生物分离领域。

生物分离是现代生命科学技术发展的重要支撑领域。在科学实验室，生物分子被分离，以确保为进一步研究提供纯物质。在工业上，各种生物制品，如血液蛋白、疫苗和重组药物，必须进行纯化，以保证安全性、活性和长期稳定性。尽管它很重要，但并没有多少研究者愿意从事生物分离研究，因为它涉及多学科知识和专业知识经验。此外，它不是一个产生高影响因子期刊的出版物的领域。

我和苏教授都对生物分离有着浓厚的兴趣，因为我们都意识到它在解决生命科学实验室和工业中的实际问题方面的力量。20多年来，我们在创新的道路上进行了合作。在此，我将介绍我们的一些研究成果和相应的技术。

此领域是我们成功合作的代表。在大肠杆菌中通过过表达生产基因工程蛋白时，往往很难避免包涵体的形成，需要将变性蛋白恢复到其自然活性状态。包涵体蛋白的形成具有表达量高、发酵时间短、易于与其他组分分离等优点。然而，包涵体蛋白必须用强变性剂如盐酸胍或尿素溶解，然后重新折叠到其自然活性的结构。不幸的是，错误折叠和聚集体的形成是难以避免的(图1)。稀释复性是工业中常见的方法，它增加了工艺流程时间和造成了极低的蛋白质浓度。

我们的想法是用一种固体介质来辅助蛋白质折叠复性。固体介质可以通过各种相互作用如亲水性、疏水性或物理结构来结合蛋白质。正确控制这些相互作用将有助于变性蛋白在不发生错误折叠的情况下折叠成正确的构象。这个想法让我们想起了用于蛋白质纯化的层析填料。如果变性的蛋白质在层析过程中与固体填料结合时能够折叠，那么它可能是蛋白质重新折叠和分离的有效结合。因此，我们为实验方法精心设计了以下策略：

1、创造一种在层析柱中变性剂浓度逐渐降低的环境，以避免变性剂浓度突然变化引起的分子聚集。根据蛋白质分子的再折叠热力学和动力学，设计了蛋白质分子的渐进变化策略。该过程使用计算机层析工作站进行，使不同的溶液环境成为可能。

2、聚焦于尺寸排阻，离子交换和疏水相互作用，因为这些是最常用的蛋白质分离层析工艺。挑战在于重新折叠和分离的同时动力学控制。如果成功，重折叠复性过程可以很好地集成到当前的工业工艺中。

3、以溶菌酶作为模型，溶菌酶是一种很容易表征和记录良好的蛋白质，但目标是解决基因工程包涵体蛋白的实际复性问题，如粒细胞集落刺激因子(GCSF)、干扰素、单链抗体(scFV)、非糖基化促红细胞生成素(ngEPO)等。

我们的合作取得了令人振奋的成果。第一种方法是尺寸排阻层析(SEC)重折叠。如图2所示，尿素浓度沿SEC柱长度从6 M下降到1 M, pH从6上升到10。变性溶菌酶在6 M尿素中，pH为6，向下移动并逐渐折叠到其原始活性结构。与稀释复性相比，在蛋白浓度为30 mg/mL时，SEC复性使活性回收率从30提高到80%。

图3为单链抗体scFv 57P的重折叠比较结果。显然，SEC柱层析重折叠极大提高了收率。尿素和pH双梯度复性法的回收率最高。然后将其扩展到离子交换层析(IEC)和疏水作用层析(HIC)。

这一策略如图4所示，随着变性蛋白吸附在固体基质上，变性剂浓度的降低开始了重折叠复性的过程。最后的氧化步骤是为了在分子中形成二硫键，这在重折叠复杂蛋白质时是必要的。

表1显示了重组人溶菌酶复性稀释复性和IEC复性的比较。虽然稀释时间较短，但其最终浓度很低，为0.03 mg/mL。而IEC再折叠蛋白的浓度则高出20倍以上，达到0.8 mg/mL左右。

总结以上三种层析过程的结果，可以形成如图5所示的通用层析方案，其中层析柱可以是SEC、IEC、HIC或亲和(AC)。浓度变化(梯度)并不局限于pH值或变性剂，但可能扩展到各种电解质、分子伴侣和氧化剂，这些都是重折叠特定目标所必需的。

我们的方法很快被其他研究人员采用，他们开发或改进了新的层析复性工艺。我们此工作发表的论文被引用了数百次。其中一篇论文在2002年的《Protein Expression and Purification》杂志上被评为下载前五名。制药公司向我们寻求帮助，解决重组蛋白的重折叠问题，如人单链抗体、人溶菌酶、Fe-SOD、人菌落刺激因子、α-干扰素、金黄色葡萄球菌延长因子G等。

长期以来，我和苏教授一直对新型高效层析纯化填料感兴趣。虽然以海洋多糖琼脂糖为基础的微球在蛋白质纯化方面的应用已超过50年，但它们存在三个缺点。一是由于工业生产过程是基于机械搅拌的，所以它们具有多分散性，因此粒径分布较宽(图6)。二是由于溶液粘度很高，机械搅拌很难制备高浓度琼脂糖微球。第三，很难制备工业规模上高分辨率分离需要的小于20微米的琼脂糖微球。

位于瑞典乌普萨拉的GE Healthcare(现Cytiva)是世界领先的生物科学研究和生物技术产业层析填料和设备的制造商。马教授和苏教授的科研成果引起了公司的浓厚兴趣，公司决定与两位教授及其研究所签订合同，进行膜乳化技术的技术转让。合作非常成功。因此，利用膜乳化技术，Cytiva现在正在生产，并在全世界范围内销售，尺寸均一的琼脂糖多糖微球，商品名为Superdex 200 Increase, Superdex 75 Increase, Superdex 30 Increase和Superose 6 Increase，作为纯化多肽、蛋白质、抗体、疫苗和各种药物的先进层析填料。这是该公司首次在产品开发和生产中采用中国发明。

图8是苏志国教授和马光辉教授访问我家的照片。这次对乌普萨拉的访问是由GE Healthcare公司发起和组织的，以表达他们对帮助公司开发新的先进产品以造福于生物科学和生物技术的发明者的尊重和感激。这次马教授应邀为公司的科学家们做了关于微球制备工程的讲座。

3. 层析工艺的协同创新

层析技术是生物科学实验室和生物技术行业的一项重要技术，一直是我和苏教授合作的重点。原因可以归结为我们对各种蛋白质分离需求的知识和经验，过程科学和工程的基础，以及我们对创新的共同兴趣。

除了前几节介绍的层析折叠复性和层析填料设计外，我们还开发了新的层析工艺。第一个是纯化复杂的超大疫苗抗原。该纯化方法以前主要采用分辨率低、运行成本高的超速离心法。通过对固定相、流动相和纯化方案的合理设计，我们证明了层析法在获得纯抗原方面优于传统技术的优良效果和分辨率。第二个使用先进的技术（如多角度激光光散射，场流分馏，氢氘交换核磁共振）开发在线/离线表征和抗变性策略。发现和发明是通过过程分析技术(现在称为PAT)的结合而产生的。例如，随着固定相配体密度的增加，培养基与复杂蛋白的接触面积增加，这可能导致蛋白质结构改变和变性的可能性增加。通过降低配体密度和改变固相的微观结构，可以保留蛋白质的三维结构，以保证高的生物活性。

如果没有苏教授的大量投入和贡献，就不可能有任何合作的成功。通过我们的合作，他解决了多尺度工艺挑战，采取了独特的，创造性的，系统的，但仍然是基本的方法。他的领导力不仅在研究方面，而且在学生教育和年轻员工提升方面，在层析和广泛的生物分离领域的成功中发挥了关键作用。

在这里，我想提一下苏教授派往乌普萨拉大学进行合作研究的学生和工作人员。首先，1999年，最能干、最勤奋的博士生谷振宇先生来到乌普萨拉大学，从事蛋白质尺寸排阻层析复性的研究。他的工作是第一个利用生产级层析对蛋白质进行重折叠复性的研究，他的论文多次被其他研究人员引用。谷振宇博士目前是美国一家生物制药公司的高级工艺科学家。接下来是杨青女士，她将蛋白质克隆和表达与凝血酶样酶的层析纯化结合起来，这是生物医学的一个重要候选物。杨博士现为中国大连理工大学生物技术特聘教授。李明先生利用离子交换层析(IEC)技术在蛋白质重折叠方面进行了另一项重要的创新，由于IEC是生物技术行业最常用的技术，因此不仅引起了学术界的兴趣，也引起了工业界的兴趣。现任丹麦知名生物科技公司Novozymes高级工程师。

在取得上述成功后，我们重点介绍了第三种常用的层析技术——疏水相互作用层析(HIC)。李京京先生从事HIC重折叠的研究。他将梯度控制扩展到包括分子伴侣以保护重折叠中间体，并成功完成了几种药物蛋白的重折叠。李京京博士毕业后来到瑞典斯德哥尔摩皇家学院，后定居美国，在一家生物技术研究机构工作。

顾铭博士在天然产物纯化新技术的开发方面取得了突出的成就。她建立了蚌类黏附蛋白(MAP)的纯化新方法，首次使用多糖层析填料纯化多种天然产物，并发表多篇学术论文。罗坚博士、郝冬霞博士在场流分级和氢氘交换NMR研究方面也取得了显著进展。顾博士、罗博士、郝博士先后担任中国科学院过程工程研究所生物技术项目负责人。

4. 合作受到了高度的鼓励、推荐和奖励

瑞典和中国有着悠久的科学交流历史。苏教授和我之间的合作很幸运得到了双方科技机构的支持，包括瑞典生物技术发展委员会(NUTEK，后来的VINNOVA)，中国国家自然科学基金委(NSFC)，乌普萨拉大学，中国科学院过程工程研究所。在这些强有力的支持下，我经常从瑞典到中国，苏教授和他的同事们也经常从中国到瑞典的乌普萨拉。

通过合作，我认识了许多中国大学、研究机构和行业的新朋友，并形成了广泛的合作，包括会议演示、大学讲座、学生辅导课、产品开发、技术故障排除等。

长期与中国朋友的成功合作给我带来了莫大的荣誉。因此，在2016年，我获得了享有盛誉的中华人民共和国国际科学技术合作奖(图9)。该提名由中国科学院发起，马光辉教授为推荐团队组长，苏志国教授、刘铮教授(清华大学)、谭天伟教授(北京化工大学)支持。

最后，我要对苏教授长期以来的合作、热情好客、友谊和支持表示衷心的感谢。他值得Engineering in Life Sciences的特刊，因为他是中国生物化学工程领域的一位有影响力的领导者，在国内和国际上都有创新的研究和教育倡议。他激励了中国年轻的生物化学工程师将理论研究成功转化为应用，这是他为SKLBE建立的学说。在本期特刊中，苏教授的同事、朋友和学生报道和展示了生物化学工程的创新研究进展，这是对苏志国教授取得的非凡成就的致敬。

【苏志国教授简介】

　　研究方向为蛋白质分离纯化和修饰。承担并完成了国家自然科学重点基金、863、973、国家重大科技专项等多项研究课题。发明了分离纯化新技术，解决了多个疫苗和蛋白质药物的纯度问题和失活问题；创新和发展了蛋白质的大规模修饰技术，提升了我国血液代用品和长效蛋白质药物的产业化能力；实现了生物分离纯化介质和设备的国产化、系列化和创新化。在担任国家863重大机密项目“人工血液代用品的研制”负责人和北京凯正生物工程发展有限公司（该重大机密项目的实施体）总工程师过程中，带领科研人员采用膜分离与层析纯化相结合，突破了以往大规模纯化蛋白质杂质含量高、收率低、修饰蛋白质不均匀的难题，发展了有自主知识产权的工艺路线，连续15批中试产品合格，在生物学实验中表现了近似于人体原血的输送氧功能，克服了免疫原性、肾毒性，被两院院士评为“1999年我国十大科技进展”之一。在人工血液代用品的研究和与企业的合作研究中，发展了多种修饰剂的制备技术，制备了单链、双链、分叉、分枝以及不同末端活性的聚乙二醇修饰剂。发展了能保持均一修饰度、保持蛋白质活性的聚乙二醇、白蛋白、葡聚糖修饰蛋白质的技术和工艺路线，以及以毛细管区带电泳、多角度激光散射、色谱-质谱联用等高效质控分析技术。发明了人工伴侣辅助的蛋白质折叠与纯化和梯度层析复性蛋白质技术。

转自：下游工艺文献分享荟