简单,低成本一步层析的逆转录病毒载体生产工艺

2021-09-24

逆转录病毒载体可以整合7.5Kb左右外源基因整合入靶细胞基因组并稳定持久地表达,已经在批准的CAR-T产品和许多临床产品中得到应用。第一个成功的基因治疗临床试验是利用小鼠白血病病毒(Murin Leukemia Virus,MLV,γ逆转录病毒)作为基因转移载体治疗儿童的X性染色体连锁严重联合免疫缺陷(SCID-X1)。目前上市的6个细胞治疗产品全部采用逆转录病毒(3个为γ逆转录病毒载体,3个慢病毒载体)作为基因转移载体。

逆转录病毒载体目前常用的主要有两个:γ逆转录病毒载体(Retroviral vector,RV)和慢病毒载体(Lentivirus vector,LV)。两种病毒均属于逆转录病毒科,在自身携带的逆转录酶催化下将其正链RNA均逆转录为cDNA。病毒颗粒比较大,约为100nm(70-100nm,有的至200nm),外层为表面突起的脂蛋白套膜,套膜内为20面体的衣壳(capsid),核衣壳内有一螺旋结构的核糖核蛋白。

全球获批CAR-T产品

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病毒载体作为细胞治疗载体是细胞生产的关键原材料,直接关系到细胞产品质量,载体质量的控制和工艺稳定性和批间一致性都是关系到产品能否产业化的关键。在生产纯化过程中,需要去除上游过程中的培养基成分,诱导剂,宿主蛋白和核酸等杂质,但是由于逆转录病毒颗粒比较大,高异质表面糖蛋白,而且活性易于受剪切影响,对下游纯化提出了巨大的挑战。

目前病毒载体纯化方法包括超速离心、离子交换层析、分子排阻层析、亲和层析、渗滤等。各种方法各有利弊,就产业化而言,离子交换纯化效果比较好,条件易于摸索,易于规模放大。

下面工艺采用一步离子阴交换层析(Nuiva Q)纯化逆转录病毒载体,经过小试条件摸索,优化至产业化放大,最终可以在4小时内处理250L的样品,产品检验合格,满足临床用药要求。


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工艺优势:

1、工艺稳定,易于放大。层析处理规模从18ml到240L,放大了约13000倍,满足临床用药需要。

2、高效。工艺流速达到400cm/h,240L样品工艺时间为4小时。

3、高回收率。总回收率高于65%。

4、该工艺也适用用其他慢病毒载体的纯化。



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