醋杆菌产纤维素发酵条件的优化

2019-05-19 06:29:09


细菌(fungus)纤维素,也称微生物纤维素,是一种新型的生物材料,是近年来生物材料研究开发的热点之一。Brown 于1886年首次发现并报道,当木醋杆菌Acetobacter xylinum静止培养时在培养基与空气界面产生的一层白色膜状物质——细菌纤维素。细菌纤维素由于具有纯度高,强度(strength)高,亲水性好等特点,在食品、造纸、声音振动膜、人造皮肤的制造及造纸行业有着广泛的应用(application)前景。由于纤维素合成酶基因的不稳定性,一般情况下细菌纤维素由 Acetobacter xylinum 静止浅盘培养产生,但是这种方法(method)存在一些弊端,如浅盘表面积大易造成发酵液大量挥发损失,生长缓慢发酵时间长等等,这些都导致了成本的提高。近年来,人们致力于选育能够通气搅拌培养的Acetobacter xylinum 菌株,以提高纤维素产量,降低成本。本实验室最近筛选到一株在搅拌培养条件下,能高产纤维素的 Acetobacter xylinum菌株。
1 材料与方法
1.1 材料(Material)
菌(fungus)种   Acetobacter xylinum C2(本实验室保藏) 。
培养基  蔗糖7%,酵母膏0.7%,蛋白胨1.1%,MgSO4·7H2O0.2%,柠檬酸三钠0.1% 。生物技术展淀粉糊化作用的测定方法:有光学显微镜法,电子显微镜法,光传播法,粘度测定法,溶胀和溶解度的测定,酶的分析,核磁共振,激光光散射法等。工业上常用粘度测定法,溶胀和溶解度的测定。二、酸变性淀粉在糊化温度以下,用无机酸处理淀粉,改变其性质的产品称为酸变性淀粉。
培养条件(tiáo jiàn) 29℃,摇瓶培养6d。
主要仪器 摇瓶培养箱,真空循环水泵等。
主要试剂 蔗糖,蛋白胨,酵母膏,柠檬酸钠(Sodium),M g S O4 等。
1.2 纤维素产量的测定
细菌纤维素收获后,以布氏漏斗抽滤除去纤维素中的培养基并用去离 子 水 反 复 洗 涤 。上海发酵展淀粉有直链淀粉和支链淀粉两类。前者为无分支的螺旋结构;后者以24~30个葡萄糖残基以糖苷键首尾相连而成,在支链处为-1,6-糖苷键。将纤维素悬于4%NaOH 溶液,100℃保温(Heat preservation)20min以除去菌体。用去离子水和 0.5% 乙酸溶液连续洗涤纤维素至中性。纤维素在80℃干燥(drying) 1~2h 后称重。
1.3 最佳发酵温度的确定
使用基础培养基,分别在室温(约 24℃)、27、30、33、36℃培养 Acetobacter xylinum C5,6d 后测定细菌纤维素产量,比较温度(temperature)对产量的影响。
1.4 最佳pH 值的确定
在发酵(fermentation)过程中,培养基的 p H 值并非恒定的,而是随发酵过程不断变化,因此本实验只是进行对最佳的初始pH 的确定,选择范围在 pH3.0~7.0 之间。使用基础 培养基,27℃培养Acetobacter xylinum C5,6d 后测定细菌纤维素产量,比较 p H 对纤维素产量的影响。
1.5 最佳装液量的确定
分别在不同容积的烧杯中装入不同体积的基础培养基,培养6d 后测定特殊结构:荚膜、鞭毛、菌毛纤维(Fiber)素产量,比较培养基液面积和液深对纤维素产量的影响。
1.6 最佳转速的确定
在静止和不同转速条件(tiáo jiàn)下振荡培养AcetobacterxylinumC2,6d 后测定(gage)细菌纤维素产量,比较转速对纤维素产量的影响。
1.7 发酵周期的确定
使用基础培养基在27℃培养Acetobacter xylinum C2,从第24h 起,每12h 测定一次细菌纤维素产量,绘制纤维素产量变化曲线,比较发酵时间对纤维素产量的影响。
2 结果与讨论
2.1 最佳温度的选择
使用最佳发酵培养基,对发酵温度测定结果如图1所示。由图1可看出,Acetobacter xylinum C2在27℃发酵生产细菌纤维素的产量最高,而27~30℃是产生纤维素的最适温度范围。当培养温度达到 36℃时,AcetobacterxylinumC2细胞不能生长,细菌纤维素完全不能产生。
2.2 最佳 pH 的选择
在最佳发酵温度下,对最佳发酵pH 的测定结果如图2所示。由图2可看出,Acetobacter xylinumC2 发酵生产细菌纤维素的最适 pH 范围在 4.0~4.5 之间。超出这一范围,则纤维素的产量大幅下降。随着发酵液起始 pH 的升高,发酵液终点的pH 也不断升高。这和另一株菌 Acetobacter xylinumC5的特性不太一样,无论Acetobacter xylinumC5发酵液起始的pH是多少,其发酵终点的 pH 都在 3~4 之间。
2.3 最佳装液量的选择
分别在 250ml三角烧瓶和500ml三角烧瓶中装入50~350ml 体积不等的培养基,分别在静止和振荡条件下培养Acetobacter xylinum C2,以测定供氧量对该菌生长的影响。测定结果如图3及图4所示。由图3和图4可以看出,无论是250ml 三角烧瓶还是500ml三角烧瓶,无论静止培养还是振荡培养,纤维素产量变化的趋势是相同的。即随装液量的增加,细菌纤维素的产量都是逐渐下降的。

2.4 转速的影响
分别在静止和不同转速情况(Condition)下培养Acetobacter xylinumC2,测定的细菌纤维素产量如图5所示。比较图中数据可以知道,Acetobacter xylinumC2在静止和相对低的转速(160r/min)条件(tiáo jiàn)下发酵生产细菌纤维素的产量比较高。在高转速下,细菌纤维素也能产生,但是产量相对较低。 静止培养和摇瓶培养所得到的纤维素的形态是不一样的。静止培养得到的细菌纤维素为薄膜状凝胶,而振荡培养得到的纤维素呈团块状,当培养液很多时,纤维素会呈细碎的米粒状。
2.5 发酵终点的选择
采用最佳发酵(fermentation)培养基,pH 值为4.5,装液量为50ml发酵液/250ml 三角瓶,在27℃,160r/min 摇瓶培养,测定纤维素产量变化曲线,并以此确定发酵终点。上海生物发酵展淀粉在餐饮业中又称芡粉,水解到二糖阶段为麦芽糖,完全水解后得到单糖。结果如图6 所示。在最初培养的24h,看不到明显的纤维素产生。从36h开始,培养液中有丝状或条状的纤维素产生。此后纤维素产量不断增加,纤维素纠结在一起形成团块状。至204h 产量达到最大值,此后产量在平稳中有所下降(descend)。因此确定Acetobacter xylinum C2发酵生产细菌纤维素的终点为204h。
3 结论
本实验室条件下,醋杆菌Acetobacter xylinumC2发酵产生细菌纤维素的最适温度为27℃,最适pH为4.5,装液量50ml/250ml三角瓶,转速160r/min,发酵终点204h。